固相多肽合成儀操作步驟及其基本原理

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固相多肽合成儀操作步驟及基本原理
一、基本原理
1.固相多肽合成（SPPS）通過逐步連接氨基酸殘基構(gòu)建多肽鏈，其核心原理包括：
固相載體固定：
羧基端（C端）氨基酸通過共價鍵（如酯鍵）固定在樹脂等不溶性載體上，形成反應(yīng)錨點。
樹脂選擇需考慮化學(xué)穩(wěn)定性及后續(xù)切割條件（如TFA或HF裂解）。
2.保護基團策略：
α-氨基保護：常用Fmoc（堿性脫除）或Boc（酸性脫除）基團，防止氨基自反應(yīng)。
側(cè)鏈保護：根據(jù)氨基酸特性選擇保護基（如Trt保護半胱氨酸的巰基），避免副反應(yīng)。
3.脫保護-活化-偶聯(lián)循環(huán)：
脫保護：去除當(dāng)前氨基酸的α-氨基保護基，暴露活性氨基（如用哌啶脫Fmoc，TFA脫Boc）。
活化：下一個氨基酸的羧基通過縮合劑（如HBTU/HOBt或DCC/DMAP）活化，形成反應(yīng)性中間體。
偶聯(lián)：活化氨基酸與固相載體上的氨基縮合，形成肽鍵，延長肽鏈。
4.切割與純化：
切割：用強酸（如TFA）裂解肽鏈與樹脂的連接鍵，同時脫除側(cè)鏈保護基。
純化：通過HPLC、離子交換色譜等方法去除雜質(zhì)，獲得目標(biāo)多肽。
優(yōu)勢：固相載體便于分離液相雜質(zhì)，減少中間純化步驟，提高合成效率。


二、操作步驟（以全自動合成儀為例）
1.設(shè)備準(zhǔn)備與校準(zhǔn)
安裝調(diào)試：由專業(yè)人員安裝設(shè)備，檢查溶劑儲液瓶、氣體管道連接，確認(rèn)儀器各部分完好。
壓力校準(zhǔn)：
壓縮空氣（AIR）壓力：60-100 psi
氮氣（N?）壓力：5-10 psi
系統(tǒng)測試：包括泵、閥、檢測器、溫度控制、反應(yīng)器攪拌等，確保運行正常。
2.反應(yīng)容器與試劑準(zhǔn)備
反應(yīng)容器選擇：根據(jù)合成規(guī)模（如0.1-16 mmol）選擇合適樹脂柱，確保材料不與反應(yīng)物反應(yīng)。
樹脂處理：
用二氯甲烷（DCM）溶脹樹脂，抽干。
用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）洗滌樹脂，去除雜質(zhì)，抽干備用。
試劑配制：
稱量氨基酸、活化試劑（如HBTU）、溶劑（DMF、DCM）等，確保新鮮純凈。
將試劑裝入貼有標(biāo)簽的儲液瓶，按順序放入合成儀。
3.合成程序設(shè)置與啟動
參數(shù)設(shè)定：
溫度：根據(jù)試劑穩(wěn)定性設(shè)定（如室溫至70℃）。
反應(yīng)時間：脫保護、偶聯(lián)步驟時間需優(yōu)化（通常數(shù)分鐘至數(shù)小時）。
溶劑流量：通過電磁閥校準(zhǔn)，確保精確控制。
序列輸入：在合成儀軟件中輸入目標(biāo)多肽的氨基酸序列（從C端到N端）。
啟動合成：運行預(yù)設(shè)程序，儀器自動執(zhí)行以下步驟：
脫保護：加入脫保護試劑（如20%哌啶/DMF）脫除Fmoc基團，洗滌去除副產(chǎn)物。
偶聯(lián)：將活化氨基酸溶液投入反應(yīng)器，攪拌進行縮合反應(yīng)。
洗滌：用DMF、DCM等洗滌樹脂，清除未反應(yīng)物質(zhì)。
循環(huán)重復(fù)：直至完成所有氨基酸連接。
4.切割與純化
切割：
配制裂解液（如TFA/水/三異丙基硅烷（TIPS）=95:2.5:2.5），預(yù)冷至0℃。
將肽樹脂加入反應(yīng)釜，加入裂解液，攪拌反應(yīng)2小時。
抽濾去除樹脂，用TFA洗滌樹脂，合并濾液。
濃縮與沉淀：
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮濾液至小體積。
加入冷甲基叔丁基醚（MTBE）沉淀多肽，離心收集粗肽。
純化：
使用HPLC（如C18柱）分離目標(biāo)多肽，流動相為乙腈/水（含0.1% TFA）。
收集目標(biāo)峰，凍干獲得純品。
5.質(zhì)量控制與記錄
檢測方法：
紫外檢測：監(jiān)控脫保護和偶聯(lián)步驟的吸光度變化。
質(zhì)譜分析：確認(rèn)分子量及純度。
記錄參數(shù)：詳細(xì)記錄試劑用量、反應(yīng)時間、溫度、壓力等，生成實驗報告。

三、關(guān)鍵注意事項
1.試劑純度：使用高純度試劑（如HPLC級）避免雜質(zhì)引入。
2.反應(yīng)監(jiān)控：通過UV檢測或質(zhì)譜實時監(jiān)控反應(yīng)進程，及時調(diào)整參數(shù)。
3.設(shè)備維護：定期清洗管路、更換密封圈，防止交叉污染。
4.安全操作：裂解液含強酸，需在通風(fēng)櫥中操作，佩戴防護裝備。